關鍵詞：N-Nitrosamines，NDSRIs，N-亞硝胺，OECD 471，Enhanced Ames test，增強型Ames，Mutation Test，Induced Hamster Liver S9, 誘導倉鼠肝S9，誘導金黃地鼠肝S9，CYP450

細菌回復突變試驗，又稱Ames試驗，是一種廣泛用于檢測化合物誘變潛力的毒理試驗。盡管其是驗證化合物致突變作用的基石，但在評估一些需要復雜代謝激活的化合物時[如N-亞硝胺(N-Nitrosamines, NDSRIs)]，標準的Ames試驗表現(xiàn)出了明顯的局限性，因此，在OECD 471導則下增強Ames（Enhanced Ames）應運而生。

一、N-亞硝胺的基本概念

N-亞硝胺類雜質(NDSRIs)是一類分子中含有N-亞硝基結構的化合物（N-nitrosamines），含有亞硝基官能團，結構式一般為R1（R2）N-N=O。該類化合物常以痕量存在于自然界和食品中，包含空氣、水、食物等各種生物生存所依賴的介質中，因此藥物的制備和生產過程中不可避免地引入該類物質。但多種N-亞硝胺物質已表現(xiàn)出明確的基因毒性，會造成DNA損傷并進一步發(fā)展成癌癥，且極低地劑量暴露也會導致相同結果。

O-亞硝胺的遺傳毒性往往不依賴于其藥物本身，而是其活化后的代謝產物具有致癌性。N-亞硝胺的遺傳毒性機制為：代謝活化（CYP450）→ 生成烷化劑（CH??）→ DNA加合物（O?-MeG）→ G→A突變 → 癌基因激活/抑癌基因失活 → 癌癥。

(1)      代謝活化：N-亞硝胺化合物先經細胞色素P450（如CYP2E1）代謝活化，生成具有高度反應活性的烷化中間體（如重氮烷、碳正離子），以下為以NDMA為例的經典代謝途徑：

(2)      DNA烷基化：活性中間體（如CH3+）攻擊DNA堿基，形成DNA加合物，主要靶點包括

O?-甲基鳥嘌呤（O?-MeG）（最-具致突變性）、N?-甲基鳥嘌呤（N?-MeG）（較常見但修復較快）和N3-甲基腺嘌呤（N3-MeA），其中O?-甲基鳥嘌呤（O?-MeG）是關鍵損傷。即在DNA復制時，O?-甲基鳥嘌呤傾向于與胸腺嘧啶（T）配對（而非正常的胞嘧啶），導致了G→A突變（點突變），若該過程未被修復，則可引發(fā)RAS、TP53等關鍵基因突變，從而促進癌癥發(fā)生。

目前，國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）已將多種N0亞硝胺化合物列為致癌物，其中N-二甲基亞硝胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亞硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被列入2A類致癌物，其他幾種藥物歸為2B類致癌物。且根據國際人用藥品注冊技術要求協(xié)調理事會（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）M7指南指出亞硝胺類藥物相關雜質（N-Nitrosamine Drug Substance Related Impurities, NDSRI）是一類在藥物中可能存在的亞硝胺類致癌雜質，具有高度致癌性，被歸為I類雜質，需要嚴格控制。因此，對N-亞硝胺類化合物進行合理的遺傳毒性試驗是非常必要的。

二、增強Ames試驗（Enhanced Ames Test）

作為金標準的經典Ames試驗，在面對某些N-亞硝胺（如NDMA）時也會出現(xiàn)靈敏度低、伴有假陰性結果的可能性。這是因為標準Ames Test具有一定的局限性，如代謝活化系統(tǒng)CYP酶表達不強、突變譜檢測有限等問題，因此EMA“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）"中指出針對某些N-亞硝胺的Ames檢測應遵循FDA國家毒理學研究中心提供的增強Ames（Enhanced Ames Test）試驗條件進行驗證。該指導對菌株選擇、試驗方法、活化系統(tǒng)、陰性/陽性/溶劑對照等均提出了新標準。

菌株選擇

要求：鼠傷寒沙門氏菌TA98, TA100, TA1535,TA1537；埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA（pKM101）

試驗方法

要求：預保溫和非平板摻入法

預保溫時間

要求：30 min

S9種類、濃度

要求：30%誘導大鼠肝S9和30%誘導倉鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）或誘導金黃地鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）

陰性/溶劑對照

要求：水；有機溶劑：如乙腈、甲醇和二甲基亞砜（DMSO）

陽性對照

要求：+S9：NDMA、1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌-嗪、NDSRI

其中誘導金黃地鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）或誘導倉鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）制備方法及流程與大鼠肝S9一致，均采用苯-巴比-妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導并進一步分離所得，其活性檢測也與大鼠肝S9結果相一致，但因其含有不同的CYP活性，所以是EMA建議的另一種代謝活化系統(tǒng)。

三、IPHASE 產品

綜上所述，針對不同藥物需進行的試驗也略有不同，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領者，為滿足不同化合物的研究需求，減少客戶的試劑、菌株制備過程，不僅可為客戶提供一站式標準Ames試驗多規(guī)格試劑盒，更可為客戶提供增強Ames的相應試劑和菌株，致力于為客戶節(jié)省成本、節(jié)約時間，提高試驗可重復性。

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