鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)，Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay）于 1975年建立并不斷發(fā)展完善，目前已被世界各國廣為采用，已經(jīng)成為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室必需開展的重要實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。Ames實(shí)驗(yàn)用于檢測待分析物質(zhì)的致突變作用，該驗(yàn)靈敏、高效、檢測范圍廣。

Ames 試驗(yàn)原理

Ames 試驗(yàn)利用鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，該缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長；假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌誘導(dǎo)回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9混合液。北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗(yàn)開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測。

Ames試驗(yàn)導(dǎo)則

1  范圍

本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。

2  規(guī)范性引用文件

OECD  Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。

3  定義

3.1  回復(fù)突變（Reverse mutation）

細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。

3.2  基因突變 （Gene mutation）

在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。

3.3  堿基置換突變 （Base substitution mutation）

引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對的置換。

堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。

轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。

顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。

3.4  移碼突變（ Frameshift mutation）

引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對。

3.5  鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗(yàn)（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）

    利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。

3.6  S₉

    經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯.八比鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。

4  原理

鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。可使用北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的Ames試劑盒，試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S₉混合液。

5  儀器和設(shè)備

   培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿等。

6  培養(yǎng)基和試劑

6.1  0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液

  成分： L-組氨酸(MW  155)  78mg

         D-生物素(MW  244) 122mg

         加蒸餾水至 1000mL

     配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。

6.2  頂層瓊脂培養(yǎng)基

  成分： 瓊脂粉 1.2g

         氯化鈉 1.0g

         加蒸餾水至 200mL

  配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。

6.3  Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E

  成分：枸椽酸(C₆H₈O₇·H₂O) 100g

        磷酸氫二鉀(K₂HPO₄) 500g

        磷酸氫銨鈉(NaNH₄HPO₄·4H₂O) 175g

        硫酸鎂(MgSO₄·7H₂O) 10g

        加蒸餾水至 1000mL

  配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

6.4  20%葡萄糖溶液

  成分：葡萄糖 200g

       加蒸餾水至 1000mL

  配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。

6.5  底層瓊脂培養(yǎng)基

  成分：瓊脂粉 7.5g    

        蒸餾水 480mL    

        V-B培養(yǎng)基E 10mL    

        20%葡萄糖溶液 10mL    

配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。

6.6  營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

     成分：牛肉糕 2.5g

           胰  胨 5.0g

           磷酸氫二鉀(K₂HPO₄) 1.0g

           加蒸餾水至 500mL

     配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

6.7  鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl₂)

  成分：LV化鉀(KCl) 61.5g

        氯化鎂(MgCl₂·6H₂O) 40.7g

        加蒸餾水至 500mL

  配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

6.8  0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

  成分：磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄·2H₂O) 2.965g

        磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·12H₂O) 29.015g

        加蒸餾水至 500mL

  配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

6.9  S₉混合液

  成分 每毫升S₉混合液

  肝S₉ 100ml

  鹽溶液 20ml

  滅菌蒸餾水 380ml

  0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml

  輔酶II(NADP) 4mmol

  6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol

  配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝S₉加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余S₉混合液應(yīng)該丟棄。

6.10  菌株鑒定用和特殊用途試劑

6.10.1  組氨酸—生物素平板

    成分：瓊脂粉 15g

            蒸餾水 944mL

            (V-B)培養(yǎng)基E 20mL

            20%葡萄糖 20mL

         滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL

         滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL

    配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進(jìn)熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。

6.10.2  氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板

     成分：瓊脂粉 15g

           蒸餾水 940mL

           (V-B)鹽溶液 20mL

           20%葡萄糖 20mL

           滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL

           滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL

           氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL

           四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)   0.25mL

配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液和組氨酸—生物素溶液加進(jìn)熱的溶液中去，混勻。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。

應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。

6.10.3  營養(yǎng)瓊脂平板

    成份：瓊脂粉 7.5g

          營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL

    配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。

7  試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定

7.1  試驗(yàn)菌株

    采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標(biāo)準(zhǔn)測試菌株。

7.2  生物學(xué)特性鑒定

新獲得的或長期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

表1  試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)

7.2.1  組氨酸缺陷

原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。

鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。

7.2.2  脂多糖屏障缺損

原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì)如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。

7.2.3  氨芐青霉素抗性

原理：含R因子的試驗(yàn)菌株對氨芐青霉素有抗性。因?yàn)镽因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。

7.2.4  紫外線敏感性

原理：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長，而具有完整的切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長。

7.2.5  四環(huán)素抗性

原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。

7.2.6  自發(fā)回變

原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。

鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。

7.2.7  回變特性—診斷性試驗(yàn)

原理：每種試驗(yàn)菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S₉混合液的效應(yīng)不一。

鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。

結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對某些診斷性誘變劑*的回變結(jié)果參見表2。

表2   測試菌株的回變性

   注：inh表示抑菌。表中數(shù)值均已扣除溶劑對照回變菌落數(shù)。

8  大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S₉的制備

8.1  誘導(dǎo)

廣泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑，劑量為500mg/kg體重。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯八比比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導(dǎo)劑。

•  S₉制備

動(dòng)物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化甲溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化甲溶液3mL。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S₉所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。

9  溶劑的選擇

如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗(yàn)菌株毒性低且無致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100ml。

10  劑量的設(shè)計(jì)

決定受試物高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。

對原料而言，一般高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，高劑量可為低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。

11  試驗(yàn)操作步驟

11.1  增菌培養(yǎng)

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1～2×10⁹活菌數(shù)。

11.2  平板摻入法

      實(shí)驗(yàn)時(shí)，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S₉混合液0.5mL（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。

12  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷

記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽性。

受試物經(jīng)上述四個(gè)試驗(yàn)菌株測定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無論在加S₉或未加S₉條件下為陽性，均可報(bào)告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個(gè)試驗(yàn)菌株檢測后，無論加S₉和未加S₉均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。

13  試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；

（2）試驗(yàn)菌株：所用試驗(yàn)菌株；

（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導(dǎo)劑；

（4）試驗(yàn)方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應(yīng)說明空白對照、溶劑對照和陽性對照，

      陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；

（5）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物的Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）；

（6）結(jié)論。

表1  Ames試驗(yàn)菌株的回變結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

Ames試劑盒

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對Ames試驗(yàn)開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測。

1. 誘導(dǎo) S9 采用先進(jìn)無菌凍干干燥工藝制成，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo) S9 酶活性的穩(wěn)定保存，同時(shí)有效防止了細(xì)菌污染。實(shí)驗(yàn)時(shí)用 S9 反 應(yīng)液溶解混勻。   
2. 實(shí)驗(yàn)菌株采用先進(jìn)工藝規(guī)模化制備，出廠前經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，低溫貯存條件確保了實(shí)驗(yàn)菌株的長期穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)時(shí)混 勻后即可直接使用，節(jié)省了菌株鑒定、活化處理以及菌液濃度調(diào)整等時(shí)間。     
3. 實(shí)驗(yàn)陽性對照試劑種類覆蓋整個(gè) Ames 實(shí)驗(yàn)要求，在添加和不添加 S9 的情況下均可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)菌株呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。陽性對照 試劑采購自*公司，按照 Ames 實(shí)驗(yàn)需求精準(zhǔn)定量分 裝，出廠前經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢測，陽性對照試劑的長期穩(wěn)定性有質(zhì)量 保證。
4. 底層培養(yǎng)基 VS、GS 以干粉形式提供，便于培養(yǎng)基長期穩(wěn)定 保存。使用前只需添加蒸餾水滅菌處理即可，試劑瓶采用耐高 溫材料，因此可以直接向試劑瓶中添加所需劑量的蒸餾水。
5. 頂層培養(yǎng)基 HB 凍干球采用先進(jìn)無菌凍干干燥工藝制成，使用前需先用滅菌蒸餾水溶解，然后用 0.22μm 濾膜過濾除菌。

試劑盒應(yīng)用范圍

本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作不足
周期長——培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株鑒定、菌株培養(yǎng) 等耗費(fèi)大量時(shí)間。 穩(wěn)定性差——雜菌污染、活菌數(shù)不符合要求、實(shí)驗(yàn)試劑配制不準(zhǔn) 確等都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

試劑盒優(yōu)勢
便捷—— 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。 準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，無雜菌污染， 菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

試劑盒使用操作流程
1. 實(shí)驗(yàn)器材、試劑準(zhǔn)備：三角瓶、5mL 或 15mL 試管、100μl 和1000μl 槍頭、0.22μm 濾膜、注射器、平皿、二甲基亞砜、滅菌 蒸餾水等；
2. 設(shè)置待測物劑量，配制各劑量無菌待測物溶液；
3. VS、GS 培養(yǎng)基加水溶解并滅菌，配制底層培養(yǎng)基；
4. HB 球加滅菌蒸餾水溶解，充分混勻，然后過濾除菌；
5. 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制頂層培養(yǎng)基，2ml 分裝，然后 45℃水浴保溫；
6. 用無菌蒸餾水溶解 S9 復(fù)合物并配制 S9 反應(yīng)混合液；
7. 開展 Ames 實(shí)驗(yàn)，將 2mL 頂層培養(yǎng)基+100μL 菌液+100μL 待測 物或陽性底物+500μL10% S9 混合液混勻，傾倒于底層培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)室溫度低時(shí)傾倒的頂層培養(yǎng)基易冷凝，可將底層培養(yǎng)基 放置于 37℃培養(yǎng)箱一段時(shí)間，然后再傾倒頂層培養(yǎng)基）；
8. 待頂層培養(yǎng)基冷凝后，將實(shí)驗(yàn)平皿放入 37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 48h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

試驗(yàn)方法  

試驗(yàn)方法主要是平板摻入法和預(yù)培養(yǎng)平板摻入法，具體操作如下：

1. 平板摻入法
a) 準(zhǔn)備所需底層培養(yǎng)基平皿若干。
b) 融化頂層培養(yǎng)基分裝于無菌小試管，每管2 mL，在45℃水 浴中保溫。
c) 在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入測試菌株菌液0.1 mL，混 勻；加受試物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL。需活化時(shí) 另外再加入10 % S9反應(yīng)混合液 0.5 mL），再混勻，然后迅 速傾入底層培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布 在底層上，平放固化，37℃ 培養(yǎng) 48 h觀察結(jié)果。
d) 另做一陽性對照、溶劑對照和未處理對照。陽性對照不加 受試物，只加標(biāo)準(zhǔn)誘變劑（即試劑盒陽性對照試劑，見表2）；溶劑對照加除受試物和標(biāo)準(zhǔn)誘變劑以外的所有試劑， 如溶劑二甲基亞砜等（光譜純或分析純）；未處理對照只 在培養(yǎng)基上加菌液；其他方法同上。
2. 預(yù)培養(yǎng)平板摻入法 預(yù)培養(yǎng)對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據(jù)情況確定 是否進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在加入頂層瓊脂前，先進(jìn)行以下預(yù)培養(yǎng)步
驟：在試驗(yàn)中，將受試物（需活化時(shí)另加入10% S9反應(yīng)混合 液）和菌液，在37℃中培養(yǎng)20min，或在30℃中培養(yǎng)30min，然 后再加2mL頂層瓊脂，其他同上述平板摻入法。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及受試物的特殊處理
1) 劑量設(shè)計(jì) 決定受試物高劑量的原則是受試物對試驗(yàn)菌株的毒性和受試物的溶解度。對于純的化學(xué)物質(zhì)，一般低劑量為每平皿0.2 μg，高劑量為 5 mg，或溶解度允許，或飽和濃度，或?qū)?xì)菌產(chǎn)生小毒性濃度。對于毒性很低、攝入量很大的定型產(chǎn)品，可根據(jù)其溶解度和對細(xì)菌的毒性采用可能的大劑量。每 種受試物在允許高劑量下設(shè)4個(gè)（含4個(gè)）以上劑量，每劑量間隔不超過5倍，每個(gè)劑量應(yīng)做三個(gè)平皿。
2) 溶劑 溶劑可選用水、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應(yīng)限定在毒性劑量以下。以二甲基亞砜為例，平板摻入法每皿不超過0.1mL 溶劑；預(yù)培養(yǎng)平板摻入法每皿不超過0.01mL 溶劑）， 無論選用什么溶劑均應(yīng)無誘變性。
3) 對照組的設(shè)置 試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)有陽性物對照組、溶劑對照組和未處理對照，均 包括加S9和不加S9兩種情況。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時(shí)應(yīng)在報(bào)告中說明。對以下幾種情況可作如下處理：
a)  含組氨酸受試物：根據(jù)食品中測得的組氨酸含量若能誘發(fā) 回復(fù)突變率的增高可加設(shè)組氨酸平行對照組；或?qū)z品經(jīng)XAD-II樹脂柱過濾洗脫預(yù)處理。
b)  食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成 分，可分別采取過篩抽提、蒸發(fā)殘?jiān)燃夹g(shù)處理。
c)  揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法。
d)  天然植物材料：可按植物化學(xué)方法制備粗制品或純制品。

結(jié)果的判定

以直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生 長良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的 兩倍或兩倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測試點(diǎn)有可重 復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物誘變試驗(yàn) 陽性。受試物經(jīng)上述四個(gè)試驗(yàn)菌株測定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌 株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報(bào)告該受試物對 鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個(gè)試驗(yàn)菌株檢 測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突 變陰性。

Ames 實(shí)驗(yàn)報(bào)道文獻(xiàn)舉例

 廣東省疾病預(yù)防控制中心通過 Ames 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分染發(fā)劑引起試驗(yàn) 菌株 TA97、TA98、TA100 回變率明顯升高，提示部分染發(fā)類 產(chǎn)品具有致突變作用，可對健康產(chǎn)生危害。何冬梅等、中 國 衛(wèi) 生檢驗(yàn)雜志 2007,17,(11)。
     人參與女貞子是臨床上常見的有一定抗腫瘤效果的補(bǔ)益中藥，在 Ames 試驗(yàn)中人參能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回變菌落數(shù)的增加；女貞子能抑制疊氮鈉引起的 TA100 菌株回變菌落數(shù)的增加，分別表現(xiàn)出抗移碼型突變和抗堿基置換型突變的作用。倪婭等、中國保健 2009,17,(17)。生活飲用水經(jīng)投加二氧化氯處理后對水中石油類污染物具有較 強(qiáng)的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的物質(zhì)氧化降解為 毒性較小、無致癌作用的小分子物質(zhì)，并且致突變活性明顯降低，Ames 值由陽性轉(zhuǎn)為陰性。高慶然等、工業(yè)用水與廢水2001,6。

       喹烯酮是我國自主研發(fā)的喹噁啉類一類新獸藥，作為抗菌促生 長劑用于豬飼料中， Ames 試驗(yàn)表明喹烯酮對 TA97、TA98、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定劑量下均為陽性。結(jié)果提 示，喹烯酮存在一定致突變毒性，應(yīng)制定高殘留*。張偉 等、毒理學(xué)雜志 2007,04。

      Ames 試驗(yàn)表明煤和液化石油氣（LPG）燃燒顆粒物均具有很強(qiáng) 的直接和間接致突變作用，主要致突變作用來源于硝基和胺基多環(huán)芳烴，兩種顆粒物同時(shí)存在可加大致癌風(fēng)險(xiǎn)。閆洪濤等、 中國公共衛(wèi)生 2007,04。

      烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大類表面活性劑家族，廣泛 用于家庭和工業(yè)的清潔產(chǎn)品，烷基酚類化合物是其降解產(chǎn)物， 其中對甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚、對壬基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、1,3-二氯苯酚、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 種化合物 的 Ames 試驗(yàn)表明除 2,4- 二氯苯酚未誘發(fā)各菌株的陽性反應(yīng)外，其余 11 種待測物均誘發(fā)了陽性反應(yīng),說明這 11 種苯酚類化 合物均具有致突變性。楊麗等、東北師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）
2003,01。

      重組葡糖激酶作為一種生物技術(shù)藥物具有明顯的溶栓和抗凝效果，Ames 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組葡糖激酶對試驗(yàn)菌株 TA97 、TA98、TA100 和 TA102 無誘發(fā)回變作用。劉永學(xué)等、癌變·畸變·突變 2004,9。

常見問題及原因分析
1、自發(fā)回變數(shù)顯著低于標(biāo)準(zhǔn) 原因：a. 試劑盒保存條件不合適，菌株失活或營養(yǎng)成分降解；b.培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量低；c.操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高；
2、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標(biāo)準(zhǔn) 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量高；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不*或環(huán)氧乙烷有殘留；
3、陽性底物誘變菌落數(shù)偏離標(biāo)準(zhǔn)范圍 原因：a. 陽性底物溶解不*或未充分混勻；b. 陽性底物添加量不準(zhǔn)確；c. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9失活；d. 操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高；
4、待測物誘變菌落數(shù)非常低或沒有菌落 原因：a. 待測物或待測物溶劑對細(xì)菌生長有毒性；b. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9 失活； c. 操作過程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過高；
5、菌落分布不均勻，集中偏向一側(cè)。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時(shí)平皿未水平放置；
6、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測物酸化，導(dǎo)致凝膠不充分；
7、如何判斷 Ames 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為假陽性 將經(jīng)受試物和陽性對照物處理的 Ames 菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)后接種于無組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細(xì)菌的生長情況。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長在無組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽性對照物處 理的菌株則可以生長在無組氨酸的培養(yǎng)基上,則說明經(jīng)受試物處理 的菌株沒有發(fā)生突變，試驗(yàn)中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽性。